Курсовая работа: Структурно-функціональні особливості легень у людини на етапах онтогенезу
9. Макроскопічне дослідження за методом В.П. Воробйова;
10. Метод розпилювання замороженого трупа або окремих його частин за М. І. Пироговим;
11 Гістологічні та гістохімічні методи.
Сучасна гістологія має широкий арсенал різноманітних методів дослідження. Усі ці методи поєднує застосування спеціального приладу – мікроскопа, і тому вони мікроскопічними методами. Залежно від стану досліджуваного об’єкта ці методи поділяють на вітальні – коли вивчається живі клітини, тканини, органи навіть цілі організми, та поствітальні – коли досліджують мертві фіксован об’єкти.
Становлення поствітального методу або методу виготовлення постійного гістологічного препарату, що називається методом класичної гістології.
Перший етап під час виготовлення препарату – одержання матеріалу. Для вирізання шматочка органу чи тканини, треба брати гострі ножиці чи лезо, не стискати тканину пінцетом. Шматочки беруть невеликих розмірів – близько 1 см. Матеріал повинен бути свіжим, брати його якомога швидше після забивання експериментальної тварини або смерті людини.
Наступний етап – фіксація матеріалу, яка здійснюється шляхом занурення взятого шматочка у фіксальну рідину (етиловий, метиловий спирти, розчин формаліну)
Третій етап – зневоднення фіксованого матеріалу. Для цього використовують спирти різних концентрацій, що поступово зростають від 50–70 до 100 градусів. Зневоднення необхідне для наступного етапу – ущільнення об’єкта, яке здійснюється у парафіні, целоїдині, синтетичних смолах. Для просочення ними матеріалу необхідно ретельно видалити воду з тканин, а потім просочити ксилолом (толуолом, бензолом), тобто речовиною, яка добре розчиняє парафін, а також змішується зі 100-градусним етиловим спиртом. Після просочення об’єкта рідким парафіном за температури 55–56˚С йому дають затверднути за кімнатної температури разом з парафіном у спеціальних формочках. Так отримують парафіновий блок. Ця процедура називається заливкою.
Ущільнення матеріалу дає змогу виготовити з нього тонкі (завтовшки 5–7 мкм), півтонкі (0,5–1 мкм) зрізи, які використовують для світлової мікроскопії, для електронно мікроскопії використовують ультратонкі зрізи (0,05–0,2 мкм). Виготовлення зрізів проводять на спеціальних приладах – мікротомах і ультрамікртомах. Для того, щоб розрізняти структурні деталі об’єкта, отриманий зріз треба фарбувати.
Гістологічн барвники є рослинні (гематоксилін), тваринні (кармін), синтетичні (еозин, фуксин).
Фарбован препарати звичайно обезводнюють у спиртах, просвітлюють у ксиолі і, заливаючи тонким шаром канадського бальзаму, накривають покривним склом. Після висихання бальзаму отримують постійний препарат, яким можна користуватись протягом тривалого часу.
В нашій роботі ми використовували препаровані органи, фіксовані мікрозрізи та гістологічні препарати органів дихальної системи людини.
Препарувавши органи дихальної системи, їх будову макроскопічно. З різних відділів забирали сегменти для гістологічного дослідження. Взяті сегменти фіксували в 10% розчин формаліну і по загальноприйнятій гістологічній методиці заливали в парафін. Зрізи з парафінових блоків виготовляли товщиною 5–15–20 мкм, фарбували гематоксилін-еозином і вивчали під світловим мікроскопом при різних збільшеннях [4].
Для визначення функції зовнішнього дихання використовують функціонально-діагностичні методи:
Спірографія – це графічне реєстрування змін об’єму легень під час дихання. Спірографія дозволяє одержати показники, які описують вентиляцію легень: статистичні об’єми та ємкості, як характеризують пружні властивості легень і грудної клітки, та динамічн показники, що визначають кількість повітря під час вдиху та видиху за одиницю часу. Показники визначають у режимі спокійного дихання, а деякі – при проведенні форсованих дихальних маневрів. За технічним виконанням ус спірографи поділяють на прилади відкритого та закритого типу. В апаратах відкритого типу через клапанну коробку вдихається атмосферне повітря, а повітря, що видихається, надходить до мішка Дугласа чи до спірометра Тісо (ємкістю 100 – 200 л), інколи – до газового лічильника, який безперервно визначає об’єм повітря, що вдихається. Зібране таким чином повітря аналізують: у ньому визначають поглинання кисню та виділення вуглекислого газу за одиницю часу. В апаратах закритого типу вдих та видих проводиться через дзвін спірографу. Вуглекислий газ, що видихається, поглинається спеціальним поглиначем (Додаток 10).
1. Пневмотахографія (ПТГ) – метод дослідження функції зовнішнього дихання, який полягає у графічній реєстрації швидкості руху потоку повітря (кривої «потік-об’єм») при спокійному диханні і під час виконання певних дихальних маневрів. Метод спрямований на діагностику виду й ступеня вентиляційних порушень легень на підставі аналізу кількісних та якісних змін пневмотахографічних показників.
Пневмотахограма, що реєструється при спокійному диханні, – це перша похідна спірограми, і, навпаки, спірограма може бути отримана в результаті інтегрування пневмотахограми. Хоча крива «потік-об’єм» містить в основному ту саму нформацію, що і звичайна спірограма, наочність співвідношення між потоком об’ємом дозволяє більш глибоко проникнути у функціональні характеристики як верхніх, так і нижніх дихальних шляхів.
Крім того, для вивчення різних стадій онтогенезу використовували архівний матеріал (гістологічні препарати) кафедри гістології та ембріології Івано-Франківського національного медичного університету, а також дані наукової медичної літератури Івано-Франківської обласної медичної літератури.
3. Результати досліджень та обговорення
Зачаток легень людини з'являється на 3-му тижні. Закладка легені являє собою є дивертикулоподібне випинання вентрально поверхні глоткової кишки, яке розростається в каудальном напрямі (і одночасно у вентральному). Дивертикул дає початок епітеліальній вистилці і пов'язаним з нею залозам трахеї, гортані і бронхів, а також респіраторному епітелію альвеол. Сполучна тканина, хрящі і м'язи виникають з клітин мезенхіми, розташованих навколо закладки, що росте. Формуючись в трубку, ця закладка відшнуровується від кишки в своєму каудальному кінці, все більш віддаляється від кишки до тих пір, поки не залишається невелика пов'язуюча ділянка. Ця ділянка примітивний вхід в гортань. Якщо це відділення відбулося не повністю, то між гортанню (або трахеєю) і стравоходом можуть виявлятися аномальні утворення.
3.1 Ембріогенез легень
Розвиток легенів можна розділити на декілька періодів (Додаток 8). Протягом першого з них, що продовжується з 5-го тижня до 4-го місяця розвитку, формується бронхіальне дерево. У наступному періоді (4–6-й місяць внутріутробного розвитку) закладаються респіраторні бронхіоли. Нарешті, з 6-го місяця починається третій період, що продовжується і після народження приблизно до 8-річного віку. В цей час розвивається основна маса альвеолярних ходів і альвеол.
Гістогенетичні і формоутворюючі процеси в легенях складні, і до теперішнього часу ряд важливих моментів (наприклад, питання про походження альвеолярної вистилки) залишається не цілком ясним. Немає єдиної думки і про механізм формоутворюючих і гістогенетичних процесів, що призводять до переходу закладки легені від так званої залозистої до каналікулярної і альвеолярної стадій.
Закладка бронхіального дерева і легенів по механізму виникнення і формі нагадує закладку великої залози. Приблизно до 18 тижнів розвитку закладка продовжує нагадувати залозу (залозиста стадія). Перехід від залозистої до каналікулярної і далі альвеолярної стадій зв'язується більшістю сучасних авторів з пенетрацією закладки кровоносними судинами.
Трансформація легенів, що розвиваються, починається із збільшення діаметру закладок, що мають форму залоз. Там, де сусідні просвіти розширюються, тканина між ними розтягується, стоншується, епітеліальна вистилка втрачається. Врешті-решт перегородка втрачає клітинну структуру і складається в основному з волокон ретикулінів. Подальше стоншування призводить до розриву перегородки. Кінці розірваних волокон скорочуються товщають. Таким чином виникає типова каналікулярна структура із залишками септ, виступаючими в канали «нішами», залишками зруйнованих залоз. Значна кількість кубічних епітеліальних клітин виявляється десквамірованими. Часто можна бачити групи «залоз», які вільно лежать в просвіті каналів. Епітеліальні клітини зберігаються в ділянці виступів («стиків») каналів і, можливо, відіграють роль в епітелізації альвеол.
Проте навряд чи варто вважати обидва описаних вище за механізм переходу від залозистої до каналікулярной стад такими, що взаємно виключають один одного. Скоріше навпаки: розвиток закладки відбувається у взаємодії з вростаючими судинами, роль яких в гістогенез легенів не слід применшувати.
У ранні терміни розвитку кровоносні судини розташовуються в закладці легені серед мезенхіми на значній відстані від повітряносних шляхів, що формуються. На 19–20-му тижні розвитку капіляри вперше приходять в тісний контакт з епітелієм альвеолярних ходів. Подальший розвиток капілярно мережі відбувається в ще тіснішому зв'язку з диференціюванням легеневої тканини (стромальних і епітеліальних елементів). Мабуть, поліпшення кровопостачання призводить до посилення проліферації клітинних елементів строми, диференціюванню еластичних і інших сполучнотканинних волокон.
Після відділення стравоходу і глотки трахейна частина дихальної трубки, що утворилася, швидко росте донизу, і до кінця 4-го тижня зародкового розвитку на дистальному кінці трубки виникають два асиметричні потовщення (первинні бронхіальні нирки), що є зачатками головних бронхів, причому праве випинання більше лівого, цим зумовлюється велика ширина правого бронха у дорослих. Сліпі кінці нирок активно проліферірують потенційно бронхіальним деревом і респіраторним епітелієм. Незабаром після цього кожний сліпий ентодермальний виріст дає початок ще одному випинанню у вентральному напрямі, а потім правий ентодермальний виріст дає початок краніодорсальному виросту, який пізніше стає верхньодолевим бронхом. Таким чином, на цій стад (початок 2-го місяця розвитку) нирка правої легені володіє трьома бронхіальними виростами, а ліва – тільки двома. Ці ентодермальні вирости представляють в принципі гілки бронхіального дерева дорослого, а разом з мезенхімою, що оточу х, дають початок кінцевим долям легенів дорослої людини.
Бронхи, вростаючи в мезенхіму, (навколишню епітеліальну трубку передньої кишки), дихотомічно гілкуються, утворюючи весь час на своїх кінцях кулясті розширення, з яких походить розгалуження бронхів все меншого калібру. Отже, моноподіальне галуження з 5 тижня поступається місцем дихотомічному. Процес галуження бронхів в ході ембріонального розвитку характеризується нерівномірністю в часі. Вони виявили пайові бронхи лише десь біля 6-го тижня розвитку. До кінця 6-го тижня розвитку з'являються сегментарн бронхи. Приймаючи за першу генерацію сегментарний бронх, налічується після 14-го тижня близько 15 генерацій бронхів. У крупніших сегментах зростання і галуження бронхів тривають до 16-го тижня. В результаті в крупних сегментах до цього моменту налічується 20–25 генерацій бронхів. Виключно цікаво, що в період між 10-м і 14-м тижнями внутріутробного розвитку наголошується різке прискорення процесу галуження бронхів: до 70% генерацій бронхів виникає саме в цей період. Нерівномірність процесу галуження бронхів відображає також той факт, що до 14-го тижня права легеня містить на 1–5 галужень більше, ніж ліве.
Необхідно відзначити, що із закінченням каналікулярної стадії наголошується редукція кількості генерацій, оскільки дистальні галуження перетворюються на респіраторні відділи.
У міру того як бронхіальне дерево збільшується в розмірах і протяжності, мезенхіма, що оточує легені, бере участь у формуванні зовнішнього рельєфу легені. Вона частково розділяється за рахунок утворення борозен між долями, які утворюються первинними гілками бронхів. Ц поглиблення вистилаються пізніше мезотелієм і перетворюються на вісцелярний листок плеври. На 1-му місяці розвитку навколо епітеліального вистилання трахеї, серед рихлої мезенхіми з'являються її ущільнення – закладки хряща, а на 3-му місяці ембріонального життя вже утворюється основна речовина хряща. В цей же час з'являються гладкі м'язи мембранної частини трахеї. У бронхах подібний процес закладки хрящів, колагенових і еластичних волокон і гладких м'язів можна побачити на 2-му місяці розвитку. При цьому послідовність утворення окремих шарів бронхіального дерева зберігається, як і в головних бронхах. Чим віддаленіш бронхи, тим пізніше з'являються в нім мішечкоеластичні і хрящові елементи. Так, в бронхах 2-го порядку хрящі з'являються на 6–8-му тижні розвитку ембріона, в бронхах 3-го порядку тільки з'являються їх закладки. На 6-му місяц внутріутробного життя мезенхіма пронизується бронхіолами і альвеолярними ходами. Гладком'язові елементи є тільки в стінках крупних бронхів, і то у малій кількості, з 4–5-го місяця розвитку плоду хрящі виявляються в бронхах до 4–5-го порядку. Cтінки бронхів ембріона 6-ти тижнів багаті гладком'язовими елементами, але перібронхіальна тканина ледве помітна.
Окремо розглянемо питання гістогенезу секретоутворюючих структур (залоз, келихоподібних клітин) повітроносного дерева. Відзначимо важливість функцій цих структур і в дефінітиві, і в легені, що формується (зокрема антенатальному). З цих функцій слід виділити газообмінну, захисну, у тому числі і водозахисну. Важлива захисна функція слизу у внутріутробному періоді, особливо у зв'язку з тим, що повітряпровідні шляхи заповнені рідиною.
У ембріона 13 тижнів йде закладка залоз у вигляді щільних бруньок, що утворюються в дні складок епітелію трахеї. До 14-го тижня це вже трубочки, які досягають нижнього кінця хряща. Разом із зростанням залоз йде і їх диференціація. До 6-го місяця внутріутробного розвитку залози проксимальних відділів бронхіального дерева мають ацинарну структуру. Чим дал по ходу бронхіального дерева розташовуються залози, тим менш вони диференційовані. До моменту народження залози виявляються лише у 7 із всієї кількості генерацій бронхів.
Зіставлення цих даних з картиною леген людини дефінітива створює певне уявлення про можливість формування залозистого апарату бронхів після народження. У дітей до 1 року діаметр залоз (віднесений до поперечного перетину всієї стінки бронха) більший, ніж у дорослих. Тільки до 4-го року цей показник досягає верхньої межі норми дорослого.
Становлення функцій залоз, очевидно, займа досить тривалий період. Тоді як у плодів молодшого віку кінцеві секреторн відділи дають негативну гістохімічну реакцію на мукополісахариди, у плодів 16 тижнів в просвіті ацинусів деяких бронхіальних залоз з'являється матеріал, що дає позитивну реакцію на слиз. У плоду 24–25 тижнів виявляються ацинуси, що складаються з секреторних клітин різних типів (у одних міститься відносно невелика кількість гранул, інші розтягнуті значною кількістю в'язкого, гомогенного секрету). До 25-го тижня зростає кількість півмісяцевих утворень. Ці ж типи клітин зберігаються у новонароджених і дітей перших місяців життя. Кількість півмісяцевих утворень, грануловмісних клітин у новонароджених і дітей молодшого віку менша, ніж у дорослих, а гранули дають інтенсивнішу реакцію на кислі мукополісахариди.
На додаток до сказаного слід згадати також про те, що у залоз, які розвиваються, досить рано виникає здатність до адекватної реакції на ендо- і екзогенні подразники. Так, ознаки спонтанно секреції слизу відмічені вперше у плоду 18 тижня. На 20-му тижні розвитку вдалося отримати пілокарпіновий ефект. Що стосується інших секретуючих структур бронхів, келихоподібних клітин, то вони виявляються в складках епітелію трахе бронхів. При комбінованому забарвленні (альціановий синій – реактив Шиффа) виявляється два типи клітин. Перші – дрібні, вузькі клітини, що містять рожев гранули в базальній частині і іноді синій шар у апікального кінця. Інша частина клітин переповнена секретом фіолетово-синього кольору. Чим старший плід, тим все більша кількість келихоподібних клітин зустрічається і у складі крипт особливо на поверхні і все більша частина секрету забарвлюється в синій колір. У новонародженого зустрічається ще певна кількість вузьких клітин з червоними гранулами. Надзвичайно цікаво також, що початок активної секреції залоз келихоподібних клітин співпадає з появою миготливих вій в епітел повітропровідних шляхів.
Завершуючи огляд ембріонального розвитку бронхіального дерева, відзначимо, що вже у плоду 16 тижня є в мініатюрі вс повітряносні шляхи, які можна знайти на бронхограмі дорослого. Кількість долей, сегментів, часточок, ацинусів до моменту народження в основному відповіда кількості цих утворень у дорослого. В цей же час вперше стає помітною структурно-функціональна одиниця органу дихання – ацинус.
