Быстрый поиск

Курсовая работа: Виготовлення лікарських препаратів на основі амілолітичних ферментів

ЗМІСТ

ВСТУП

1. ДЖЕРЕЛА ОДЕРЖАННЯ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ

1.1 Продуценти –прокаріоти

1.2 Продуценти дріжджеподібні гриби

1.3 Продуценти мікроскопічні гриби

1.4 Патентний пошук

1.4.1 Штам цвілевого гриба Aspergillus аwamori IMBF-100017 - продуценту амілолітичних ферментів

1.4.2 Штам бактерій Васillus licheniformis – продуцент комплексу термостабільних амілолітичних протеолітичних ферментів

2. МЕХАНІЗМ ДІЇ ТА ВЛАСТИВОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ

2.1 Властивості та структура ферментів

2.2 Класифікація амілолітичних ферментів

2.3 Механізм д амілолітичних ферментів

3. ФІРМИ ВИРОБНИКИ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

3.1 Українськ виробники

3.2 Закордонн виробники

3.3 Російські виробники

4. ГАЛУЗІ ВИКОРИСТАННЯ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

4.1 Хлібопекарська крохмалопаточна промисловість

4.2 Пивоваріння та спиртова промисловість

4.3 Текстильна промисловість

4.4 Фармацевтична промисловість

5. СУЧАСНІ НАУКОВІ ДОСЛІДЖЕННЯ, ПОВ`ЯЗАНІ З РОЗРОБКОЮ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

5. 1Комп'ютерне моделювання структурі амілолітичних ферментів

6. ОСОБЛИВОСТІ ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ ВИРОБНИЦТВА АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

6.1 Виробничі способи культивування мікроорганізмів – продутентів ферментів

6.2 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з глибинних культур мікроорганізмів

6.3 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з поверхневих культур мікроорганізмів

7. МЕТОДИКИ ВИЗНАЧЕННЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ АКТИВНОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ

7.1 Спектрофлюрометричні методи

7.2 Колориметричні (фотометричні) методи

7.3 Спектрофотометричні методи

7.4 Манометричні методи і інш методи

ВИСНОВОК

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

ВСТУП

Ферменти або ензими – органічні каталізатори білкової або РНК природи. Ферменти каталізують більшість хімічних реакцій, які відбуваються у живих організмах.

Великою незаперечною перевагою ферментів перед хімічними каталізаторами є те, що вони діють при нормальному тиску, при температурах від 20 до 70 ° С, рН в діапазон від 4 до 9 і мають у більшості випадків виключно високу субстратну специфічність, що дозволяє в складній суміші біополімерів направлено впливати тільки на визначені з'єднання.

НА сьогоднішній день в світі інтенсивно збільшується виробництво ферментів для використання їх в різноманітних ланках людської життєдіяльності. Не виняток амілолітичні ферментні препарати. Завдяки своїм особливості – каталізу реакцій гідролізу різноманітних оліго- та полісахаридів – амілолітичні ферменти використовуються в харчовій промисловості, легкій промисловості, медичній промисловості, та в діагностичних цілях. Їх використання значно спрощує та значно здешевлює технологічний процес виробництва.

Все це свідчить про те, що виробництво амілолітичних ферментних препаратів є одним з перспективних напрямків у біотехнології, що буде і далі інтенсивно розвиватися та розширюватися. І саме тому цей реферат наддає докладну інформацію про структуру та функції а також схему виробництва амілолітичних препаратів.

1. ДЖЕРЕЛА ОТРИМАННЯ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ

НА сьогоднішній день амілолітичні ферментні препарати в Україні та за кордоном набули дуже широкого використання.

До розвитку ферментної промисловості головним промисловим джерелом отримання амілаз в вропейських країнах було проросле зерно (солод). Для медичних цілей амілази отримували з тваринної сировини. В даний час головним джерелом амілаз прокаріоти, особливо бактерії, гриби і найрідше дріжджі[1,2].

1.1 Прокаріоти

Серед бактеріальної мікрофлори найбільш ефективними продуцентами є так мікроорганізми: Вас. subtilis, Вас. diastaticus, Вас. mesentericus, Вас. macerans і Вас. polymycus та ін.

Бацили продуценти амілолітичних ферментів представляють собою в більшості випадків Г+ палички довжиною 1,2 ... 1,3 мкм і діаметром 0,6 ... 0,8 мкм. Палички з'єднуються по два, три, іноді утворюють ланцюжки. собою утворюють спори, що надають стійкість клітині при дії несприятливих умов. Такі форми легко переносять висушування, низькі та високі температури, опромінення і т. д. Цикл розвитку бактерій порівняно короткий.

рН-стабільність мікробних глюкоамілаз лежить в широкому діапазоні від 2,5 до 9. Термостабільність глюкоамілаз лежить в інтервалі від 30 до 45 ° С і рідко підвищується до 55-60 ° С. Глюкоамілази різного походження помітно відрізняються по молекулярній масі, яка, за даними різних авторів, має значення від 48 000 до 210 000.

Бактерію Вас. subtilis-82, що застосовується в даний час на спиртових заводах як продуцент α-амілази в суміші з препаратами глюкоамілази, вирощують протягом 48 ... 60 годин при температурі +30 - +35 ° С.

Особливість застосування бактерій у виробництві – їх здатність утворювати високоактивну термостійку α-амілазу. Для розрідження крохмалю також застосовуються амілолітичні препарати, що містять α-амілазу: α-амілаза гідролізу внутрішні альфа-1,4-глікозидні зв'язки крохмалю, приводячи до швидкого зниження в'язкості клейстеризованих розчинів крохмалю, тим самим забезпечуючи підготовку сусла до дії глюкоамілази. Кінцевими продуктами дії бактеріальної альфа-амілази на крохмаль є низькомолекулярні розчинні декстрини з невеликим змістом моно- дисахаридів (глюкози і мальтози). [3].

1.2 Дріжджоподібні гриби

Амілолітичн ферменти синтезують також деякі дріжджі і дріжджоподібні гриби родів Saccharomyces, Candida, Endomycopsis і Endomyces.

Відомо більше 100 видів дріжджів, які добре ростуть на крохмалі як на єдиному джерел вуглецю. Серед них особливо виділяються два види, які утворюють як глюкоамілази, так і β-амілази, ростуть на крохмалі з високим економічним коефіцієнтом і можуть не тільки асимілювати, але і зброджувати крохмаль: Schwanniomyces occidentalis і Saccharomycopsis fibuliger. Обидва види - перспективні продуценти амілолітичних ферментів на крохмалевмісних відходах.

У спиртовому виробництві знайшли застосування дріжджоподібні гриби End. bispora і End. species 20-9, що вирощуються глибинним способом і продукують головним чином активну глюкоамілазу; активність ферменту виявляється слабо. Високоактивний End. bispora має розгалужений міцелій, утворює бластоспори; гіфи – септовані, зернисті; на твердих агаризованних середовищах пророщують колонії з повітряним сірувато-білим міцелієм, на рідких поживних середовищах - гіфи і деяка кількість бластоспор.

Дріжджоподібн гриби в спиртовому виробництві самостійно не застосовують, тому що вони не містять інших ферментів, необхідних для нормального оцукрювання сусла з крохмалевмісної сировини. Зазвичай їх використовують у суміші з ферментними препаратами з мікроскопічних грибів чи бактерій [4].

1.3 Мікроскопічні гриби

Для отримання амілаз широко застосовують мікроскопічні гриби роду Aspergillus, видів: niger, oryzae, usamii, awamori, batatae, роду Rhizopus, видів: delemar, tonkinensis, niveus, japonicum та ін, А також окрем штами Neurospora grassa і Mucor.

Мікроскопічн гриби дуже широко поширені в природі; основне місце їх проживання – грунт.

Всі роди і види мікроскопічних грибів характеризуються нитковидною будовою тіла і специфічною будовою плодоносних органів. Тіло гриба складається з довгих переплетених ниток сіруватого або білого кольору, що називаються гіфами. Вони поширюються по поверхні поживного субстрату, утворюючи міцелій, і частково вростають в нього. Деякі гіфи, що піднімаються над поверхнею у вигляді легкого пуху, мають більш складну будову і мають органи плодоношення, що називаються конідіями або спорангієносцями. У мукорових грибів на спорангієносця знаходиться кулевидне здуття, оточене оболонкою, всередині якого утворюються спори. У аспергіллів кінець конідієносця має булавкоподібні потовщення, від якого відходять подовжені клітини, звані стеригмами; від стеригм відшнуровуются більш дрібн круглі клітини – конідії

Відокрелен конідії або спори, потрапляючи у сприятливі умови, починає проростати, потім гіфи гілкуються, утворюючи міцелій; при виснаженні живильних речовин у середовищі гриб переходить у стадію споро- або конідієутворення. Спори конідії мікроскопічних грибів містять пігменти, що і додає зрілим культурам характерного забарвлення. Спори розвиваються трьома різними способами, в залежності від виду мікроскопічного гриба:

· як круглі ділянки в межах мережі гіфів;

· як речовина в торбинці на кінці антени Гіфа;

· як схожі на ланцюгу ділянки на кінці антени Гіфа

Аспергілли - типові аерофіли, тому вони можуть розвивватись тільки на поверхні твердого або рідкого середовища або в рідкому середовищі, що аерується. Оптимальна температура для більшості аспергіллів +25 - +30 ° С, для деяких - до 35 ° С. Більшість грибів при поверхневому культивуванні можуть переносити короткочасне підвищення температури до 40 ° С і навіть 45 ° С без помітної втрати активност ферментів. Оптимальна вологість середовища для них близько 65%.

Для живлення аспергіллів необхідні вуглеводи, азотисті і мінеральні речовини. Як джерело вуглеводу, крім моносахаридів, багатьох оліго- і полісахаридів, можуть бути спирти і органічні кислоти, однак для накопичення амілази в середовищ обов'язково повинні бути присутніми крохмаль, декстрини або мальтоза. У середовищах, що містять інші цукри, в тому числі глюкозу, гриби не утворюють амілази. Джерелом азоту можуть бути білки і їх гідролізати, амонійні солі та нітрати.

Середа повинн містити сполуки, до складу яких входять сірка, фосфор, калій, магній мікроелементи. Більшість мікроскопічних грибів засвоюють сірку з сульфатів, а фосфор – з фосфатів. Аспергілли не потребують готових вітамінах та фактори росту, тому що здатні самі синтезувати їх з більш простих сполук, що є в середовищі. Препарати ферментів з мікроскопічних грибів включають, як правило, широкий набір ферментів, тому можуть повністю замінювати зерновий солод[4,5].

1.4 Патентний пошук

1.4.1 Штам цвілевого гриба Aspergillus аwamori IMBF-100017 - продуценту амілолітичних ферментів

Суть винаходу: Винахідвідноситься дохарчової промисловості, зокрема до спиртової, може бути використаний на спиртових заводах для оцукрювання крохмалемісних субстратів. Відомі продуценти амілолітичних ферментів Asp. niger, Asp. oryzae, Rhizopus, Asp. awamon штам 224-21, 78-2, AK-1 (Глюкоамипаза микроорганизмов - M 1975 -C 6-10) Відомий штам Asp. awamon № 466, якийзастосовується на спиртових заводах дляодержання ферментів глкжоамілазного комплексу (Промисловий регламент виробництва аміпоглюкавамаріну Гх-466, Київ, 1995 - С 3 -4), але цей штам має не дуже високу активність синтезу амілолітичних ферментів За 120 -144 год росту накопичує 140-180 од/см3 активності

Задача винаходу – селекція нового штаму Asp. awamon з підвищеною бюсинтетичною активністю і швидкістю росту культури. Технічний результат, який одержують від реалізації винаходу полягає в підвищенні ферментативної активності штаму та швидкості його росту.

Описання винаходу: Досягається технічнийрезультат використанням нового штаму Aspergillus awamon IMBF 100017 – продуцента амілолітичних ферментів для оцукрювання крохмалю з підвищеною бюсинтетичною активністю. При цьому виникає пов'язана з технічним результатом споживча властивість заявляемого об'єкту – підвищення виходу і активності цільового продукту. Штам пліснявого гриба Aspergillus awamon IMBF 100017 відселекційоновано шляхом багатоступінчатого відбору з виробничої популяції продуценту амілолітичних ферментів Одержаний штам гриба Aspergillus awamon IMBF 100017 має такі морфологічні та фізіологічні ознаки.

Культурально-морфолопчн ознаки.На середовищі Чапека із сахарозою гігантська колонія на 12 добу росту при температурі 30°С має розмір 39,0 - 43,0мм, форма колоній кругла, колір колонії від темно-коричневого до чорного, край колонії нерівний, поверхня колон плоска, складчастість слабо виражена, переважно в центрі колони, пігмент із зворотної сторони колони світлокоричневий, ексудат відсутній, конід утворюються по всій поверхні колонії, більш щільно в центрі колонії, колір конідій від темно-коричневого до чорного. Через 12 діб проводять мікроскопічне дослідження колоній гриба на чашках Петрі з метою вивчення органів розмноження. При спостереженнікраюколон виявлено сегментований міцелій, від якого вертикально відходять конідієносці На х вершинах утворюються розширення у вигляді головок, або булав, на поверхн яких з'являються чисельні дрібні вирости-стеригми Стеригми прості, не розгалужуються Від стеригм відшнуровуються ланцюжки округлих гладеньких темнокоричневих або чорних конідій. Розмноження безстатеве, вегетативне, шляхом утворення конідій. Фізіологічні ознаки. На рідких поживних середовищах культура здатна утилізувати крохмаль, сахарозу, глюкозу, мальтозу.

Оптимальна температура росту на рідких поживних середовищах - 30°С.

Тип дихання – аеробний.

Технологічнахарактеристика: При вирощуванні гриба штаму 1MB F 100017 на водно-борошняній суспензії (концентрація сухих речовин кукурудзяного, житнього або пшеничного сусла повинна бути не менше 18 - 20%) культура активно синтезує ферменти глюкоамілазного комплексу При глибинному культивуванні на 5 добу в умовах інтенсивної аерації глюкоамілазна активність досягає 200 - 220 од/см3). Біотехнологічні показники заявленого штаму 1MB F 100017 ілюструються прикладом.

Приклад: Оцінку виробничих якостей штаму 1MB F 100017 проводили методом глибинного культивування на розвареній оцукреній водно-борошняній суспензії Співвідношення борошна і води 1 2,5, оцукрювали бактеріальною а-амілазою (1,5 од/г крохмалю) Витрати повітря на аерацію 25 - ЗО м3/м3/год при постійному перемішуванн 110-120 об/хв.

Температура культивування - 35°С

Тривалість процесу -120 годин

В культуральній рідині (в кінці вирощування) визначали активність амілолітичних ферментів. Дані, які підтверджують перевагу заявленого штаму в порівнянні зі штамом-прототипом, наведені є таблиці 1.1.

Таблиця 1.1. Показники продуктивності шатму гриба Asp. awamon

Показники	Штами гриба Asp. awamon
	(заявлений)	(прототип)
Тривалість процесу, год	120	144
а-аміпазна активність, од/см3	50 ±5	30 ±5
Глюкоамілазна активність од/см3	150±10	110 ± 10
Сумарна амілолггична активність, од/см3	200 - 220	140-180

Як видно з таблиці, при використанні заявленого штаму а-амілази накопичусться на 15% більше ніж за прототипом Глюкоамілазна активність - на 36% більше, ніж за прототипом Тривалість процесу накопичення ферментів скорочується на 20%

Таким чином застосування заявленого штаму дозволяє збільшити на 20 - 30% накопичення амілолггичних ферментів, а також скоротити тривалість їх накопичення на 20%

Номер патенту: 47822

Клас (и) патенту: C12N 1 / 14, C12R 1 / 665, C12P 7 / 06

Номер заявки: 2001096648

Дата подачі заявки: 28.09.2001

Дата публікації: 15.07.2002

Заявник (и): Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів.

Автор (и): Олійнічук Сергій Тимофійович; Левандовський Леонід Вікторович; Ткаченко Алла Феодосіївна; Рудніченко Людмила Вікторівна; Коваль Катерина Олександрівна; Бейко Наталія Євгенівна

Патентовласник (и): Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів.

1.4.2 Штам бактерій Васillus licheniformis – продуцент комплексу термостабільним амілолітичні і протеолітичних ферментів

Суть винаходу: винахід відноситься до біотехнології і може бути використане в спиртовому, крохмале-патоковому, пивоварному, хлібопекарському, кондитерському, плодово-ягідному, текстильному виробництвах, де потрібні ферменти, стійкі до підвищених температур. Штам бактерій Bacillus licheniformis ВКМ У-2184 Д виділений селекційним шляхом при вивченні природної мінливості штаму МКПМ В-6508 з застосуванням методів ефективного мутагенезу. Продукує комплекс, що містить не менше п'яти термостабільних амілолітичних і протеолітичних ферментів. Активний діапазон значень рН 5,0-11,0 і температури 30-105 º С з максимальною активністю альфа-амілази при 90-95 º С, пуллуланази - при 75 º С, протеази - при 60 º С. Перспективний для одночасної обробки крохмалю або крохмалевмісних сировини з метою його глибокого гідролізу і як продуцент лужних протеаз для глибокого розщеплення білків до амінокислот. Штам має підвищену здатність синтезу комплексу термостабільним амілолітичн протеолітичних ферментів, що володіє також бета-глюканазной і ламінаріназной активностями.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8