Реферат: Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності
Реферат: Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності
Львівський національний університет
ветеринарно медицини та біотехнологій
імені С. З. жицького
Остапів Дмитро Дмитрович
УДК: 636.2:631.147.611-013.11
ОКИСНО-ВІДНОВНІ ПРОЦЕСИ В СТАТЕВИХ КЛІТИНАХ БУГАЇВ І КОРІВ, СПОСОБИ ОЦІНЮВАННЯ ЯКОСТІ ТА ПІДВИЩЕННЯ ЗАПЛІДНЮВАНОСТІ
03.00.13 – фізіологія людини і тварин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора сільськогосподарських наук
Львів – 2008
Дисертацією рукопис.
Робота виконана в Інституті біології тварин Української академії аграрних наук, м. Львів.
Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор
Чухрій Борис Миколайович,
Інститут землеробства і тваринництва західного регіону УААН,
головний науковий співробітник лабораторії відтворення стада.
Офіційн опоненти: доктор біологічних наук, професор
Смолянінов Борис Вікторович,
Одеський державний аграрний університет,
завідувач кафедри фізіології та біохімії сільськогосподарських тварин;
доктор сільськогосподарських наук, професор,
академік УААН Безуглий Микола Дмитрович,
віце-президент Української академії аграрних наук;
доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Косенко Михайло Васильович, Державний науково-дослідний інститут ветеринарних препаратів кормових добавок,
заступник директора по організаційно-інформаційній роботі, завідувач відділом контролю якості ветеринарних препаратів при незаразних захворюваннях тварин.
Захист дисертац відбудеться ”17 ” червня 2008 р. о 12 год на засіданні спеціалізованої вчено ради Д 35.826.01 у Львівському національному університеті ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50, аудиторія №1.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50.
Автореферат розісланий ” 14 ” травня 2008 р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради, доктор ветеринарних наук, професор П. І. Головач
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідженнями доведені відмінності у корів заплідненості, фізіологічних, морфологічних ознак ооцитів, у плідників – показників якост еякулятів, життєздатності сперміїв (Сірацький Й.З., 1992; Яблонський В.А. та н., 1994; Гузеватий О.Є та ін., 1995; Krisher R.L., Bavister B.D., 1999; Безуглий М. Д. та ін., 2000; Косенко М.В. та ін., 2005, 2007). У зв’язку з вказаним, важливого значення набуває розробка методів оцінювання фізіологічного стану статевих клітин, корекції їхнього метаболізму для підвищення запліднення in vivo та in vitro.
Серед маркерів відтворної функції самок і самців важливим є кисень-залежні процеси (Dalvit G. C. et al., 1995; Van Blerkom J. et al., 1997; Geshi M. et al., 2000). За певних обставин, вони забезпечують ресинтез АТФ і свідчать про запліднюючу здатність сперміїв (Звєрєва Г.В. та ін., 1989), визначають розвиток кумулюсного оточення та дозрівання ооцитів (Смирнова Т.А., Галиева Л.Д., 1998), ндукують капацитацію сперміїв (Leclerc P. et al., 1996; Mankovska І.M., Serebrovska Z.O., 1998; Дутчак В.О. та ін., 2001), за нших – пригнічують синтез АТФ, активність ферментів, порушують цілісність клітинних мембран, знижують рухливість сперміїв, призводять до сповільнення мейозу (Atreja S.K. et al., 1997; Therien I. et al., 1998; Vorup-Jensen T. et al., 1999; Kim J.Y. et al., 2001). Рівновагу між окисними та відновними процесами забезпечують відповідні ферменти та антиоксиданти, зокрема, глутатіон і аскорбінова кислота, вміст яких в еякулятах впливає на життєздатність, стійкість до заморожування та запліднюючу здатність сперміїв, у фолікулах – компактність кумулюсу, дозрівання ооцитів, виживання та розвиток ембріонів in vitro (Slаweta R., Liaskowska Т., 1987; Jain M. C., Arora N., 1988; Yoshida M., 1993; Kodaman P. H., Behrman H. R., 1999; Murray A.A. et al., 2001, Смолянінов Б. В., Кротких М. А., 2004). Отже, вивчення окисно-відновних процесів забезпечить встановлення оптимальних величин їх активності, виявлення біохімічних маркерів фізіологічного стану статевих клітин самців і самок, підвищення результатів штучного осіменіння корів та репродуктивно біотехнології, розроблення способів оцінювання якості і запліднювально здатності сперміїв, ефективності вирощування ембріонів великої рогатої худоби in vitro. Поглиблені знання з фізіології статевих клітин самців і самок виявлять фактори впливу на якість сперміїв та ооцитів, забезпечать оцінювання, відбір та прискорене накопичення високопродуктивного генетичного потенціалу для створення нових генотипів тварин.
Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в Інституті біології тварин УААН та Інституті землеробства тваринництва західного регіону УААН за завданнями ”Оцінка і прогнозування репродуктивної функції великої рогатої худоби за генетичними маркерами” ( держреєстрації UA 01001641), „Розробити наукові основи підвищення репродуктивної функції корів і бугаїв новостворених генотипів чорно-рябо породи” (№ держреєстрації U 024406).
Мета і завдання досліджень. Мета роботи полягала у вивченні ролі окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв і фолікулах яєчників корів, їх впливу на капацитацію та дозрівання сперміїв і ооцитів поза організмом, розробленн способів корекції метаболізму статевих клітин, оцінювання їх фізіологічного, морфологічного стану і придатності для використання у практиці штучного осіменіння та репродуктивній біотехнології, підвищення запліднюючої здатності сперміїв, заплідненості ооцитів in vivo та in vitro.
Для реалізації мети вирішували наступні завдання:
1. З’ясувати роль окисно-відновних та синтетичних процесів у статевих клітинах і еякулятах бугаїв, кореляції між біохімічними показниками та їх вплив на фізіологічні показники сперміїв. Розробити спосіб оцінювання якості та запліднюючої здатності сперміїв за інтенсивністю дихання і активністю окисних ферментів іn vivo та іn vitro.
2. Встановити значення окисно-відновних процесів у сперміях бугаїв за д факторів капацитації та антиоксидантів. Розробити способи оцінювання капацитації сперміїв, підвищення їх життєздатності і запліднюючої здатност після кріоконсервації.
3. Вивчити окисно-відновні процеси у фолікулах яєчників корів, вплив біохімічних показників на якість яйцеклітин. Розробити спосіб оцінювання якісних характеристик ооцитів іn vitro.
4. З’ясувати окисно-відновні та синтетичні процеси в ооцитах за д субстратів ланцюга дихання та при культивуванні у синтетичних середовищах, удосконалити методи вирощування ембріонів корів in vitro.
5. Визначити нтенсивність окисно-відновних та синтетичних процесів у ембріонах корів при нкубації у поживних середовищах.
Об’єкт дослідження: фізіолого-біохімічн процеси в еякулятах і сперміях бугаїв, фолікулах яєчників, ооцитах та ембріонах корів.
Предмет досліджень: сперма бугаїв свіжоотримана розморожена, спермії, яєчники, клітини гранульозного шару фолікулів, ооцити та ембріони корів.
Методи дослідження: фізіологічні, біохімічні, цитоморфологічні, біотехнологічні, статистичні.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше доведено роль окисно-відновних процесів у забезпеченні високих значень фізіологічних показників і запліднювально здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вивчено перебіг і регуляцію окисно-відновних процесів при капацитації сперміїв та дозріванні ооцитів і, після їх запліднення, росту ембріонів. Встановлено фактори оптимально рівноваги між процесами окиснення і відновлення у статевих клітинах та маркери х інтенсивності. Вперше в спермі бугаїв установлено оптимальні рівн нтенсивності окисно-відновних процесів, межі яких забезпечують висок фізіологічні показники і запліднюючу здатність сперміїв у свіжоотриманих і розморожених еякулятах. Вивчено вплив аскорбінової кислоти відновленої форми глутатіону на енергетичний та міжклітинний обмін, значення для фізіологічного стану сперміїв, характеристики напруженості окисних процесів та ефективність впливу антиоксидантів у розріджувачі сперми на запліднюючу здатність. Доведено вплив окиснення субстратів розріджувача та середовищ культивування на фізіологічний стан сперміїв і клітин гранульози, дозрівання ОКК, запліднення і розвиток ембріонів in vitro. Встановлено зв’язок капацитац сперміїв бугаїв з придатка сім’яника зі споживанням кисню, відновною здатністю, активністю сукцинатдегідрогенази (СДГ) і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ), вмістом білків, морфологічними змінами в акросомі. Вивчено в яєчниках у зв’язку з їх фізіологічним станом динаміку антиоксидантів, білкових фракцій і глікопротеїнів, вплив на інтенсивність фолікуло- та оогенезу, якість ооцитів і придатність для використання в репродуктивній біотехнології; інтенсивність процесів окиснення і відновлення в ембріонах у зв’язку зі стадіями розвитку.
Практичне значення отриманих результатів. Удосконалені способи оцінювання якості еякулятів бугаїв („Спосіб визначення кількості живих сперміїв у еякулятах бугаїв”), підвищення стійкості сперміїв до факторів зовнішнього впливу („Спосіб захисту сперміїв бугаїв при заморожуванні”), оцінювання якості та запліднюючо здатності сперміїв за активністю ферментів дихального ланцюга („Спосіб визначення сукцинатдегідрогенази в спермі бугаїв”). Способи оцінювання якост сперміїв бугаїв включені у довідник „Фізіолого-біохімічні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині” (2004). Розроблено середовище, що забезпечує високу ефективність вирощування ембріонів корів поза організмом („Середовище для вирощування зигот корів ранніх стадій in vitro”). Матеріали дисертаційної роботи увійшли до методичних рекомендацій ”Способи оцінювання якості еякулятів бугаїв та підвищення запліднювальної здатност сперміїв”, СОУ 1.42-37-6171: 2007 ”Велика рогата худоба. Оцінювання якост еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв”.
Способи використані племпідприємствами для визначення якості та запліднюючої здатності сперми бугаїв, а капацитац сперміїв й високоефективне середовище вирощування ембріонів іn vitro для наукових досліджень та практичних робіт з отримання ембріонів великої рогатої худоби поза організмом.
Основні положення дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького, Сумського національного аграрного університету,
Харківської державної зооветеринарної академії Міністерства аграрної політики України, Львівського національного університету імені Івана Франка.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблено науково-дослідну програму, проведено експериментальні дослідження, аналіз першоджерел літератури, розроблено теоретичне обґрунтування з відбору та оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, механізмів капацитац сперміїв, оогенезу та ембріогенезу в корів, зроблені фотографії сперміїв, ооцитів і ембріонів, відзняті процеси капацитації сперміїв, запліднення розвитку ембріонів корів. Проведено статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опубліковані результати досліджень. За участю наукового консультанта розроблено схему й методичні підходи проведення досліджень.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації і результатів досліджень апробовані і схвалені на міжнародних та республіканських науково-практичних конференціях і з’їздах: “Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин, присвяченої 35-річчю Інституту фізіології і біохімії тварин та 95 -річчю від дня народження засновника нституту, академіка УА СГН, заслуженого діяча науки України, професора Ґжицького С. З.” (Львів, 1995), “Актуальні проблеми розвитку сучасної зооветеринарної науки”, (Львів, 2001), “Здобутки і перспективи ветеринарного акушерства” (Львів, 2002), “Актуальні проблеми розвитку тваринництва” (Львів, 2003), “Біологічн основи продуктивності та здоров’я тварин” (Львів, 2006), “Тваринництво XXI сторіччя: новітні технології, досягнення та перспективи” (Харків, 2006), “Механізми функціонування фізіологічних систем (Львів, 2006), “Сучасні методи репродукції сільськогосподарських тварин: стан і перспективи розвитку” (Харків, 2008).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 45 наукових праць, з яких 30 статей, СОУ 1.42-37-6171 : 2007 Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатност сперміїв бугаїв”, методичні рекомендації, 9 публікацій у матеріалах конференцій та отримано 4 патенти на винахід.
Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 4 розділів власних досліджень, висновків і практичних пропозицій, додатків, списку джерел літератури, який включає 867 назв, з них 756 іноземних. Текст викладений на 359 сторінках комп’ютерного варіанту, включає 17 рисунків і 72 таблиці.
Умовні позначення: СС – суспензія сперміїв; СМ слизова матки корови; СК – суспензія клітин; БСА альбумін сироватки крові бугая; ФР – фолікулярна рідина; ГП гепарин; АМП – амідопірин; т-БГП – т-бутилгідроперекис; МДА малоновий діальдигід; Г-SH – відновлена форма глутатіону; АА – аскорбінова кислота; ММ – молекулярна маса.
Основний зміст роботи
Огляд літератури складається з 5 розділів у яких наведені дані з характеристики фізіологічних показників та інтенсивності окисно-відновних процесів у еякулятах бугаїв та фолікулах яєчників корів, сперміях і ооцитах при підготовці і використанні їх у штучному осіменінні та репродуктивній біотехнології, впливу природних антиоксидантів та умов культивування на запліднюючу здатність сперміїв, запліднення ооцитів і розвиток ембріонів.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження виконано протягом 1994–2005 років в Інституті біології тварин УААН та Інституті землеробства і тваринництва західного регіону УААН, Львівському, Сокальському, Судово-Вишнянському, Дрогобицькому племпідприємствах, м’ясопереробних підприємствах: „Прикарпаття” та „Галев-Ресурс”.
Досліджували, отриману на штучну вагіну, сперму 72 бугаїв у віці 2–9 років (порід: української чорно-рябої молочної, німецької, голландської, голштинської чорно-рябої, британо-фризької) систематично з інтервалом 10–14 днів. Визначали у свіжоотриманих еякулятах – об’єм (мл), рухливість сперміїв (активність, бали), концентрацію (109 клітин/мл) та кількість живих (%; Яблонський В. А., 1962), виживання при температурі + 46,5°С (хв; Рослановський П., 1962) після розбавлення 1 : 10 розріджувачем для заморожування сперми в облицьованих гранулах; резистентність (тис; Смирнов І. В. , 1976); у розмороженій сперм виживання сперміїв (хв) при температурі +38,0°С. Спермії з придатка сім’яника отримували після забою бугаїв у віці 10–8 міс через надріз стінки каналу придатка з наступним вимиванням 2,8%-ним розчином натрію цитрату чи 0,9%-ним натрію хлориду. У суспензії сперміїв (СС) визначали концентрацію (109 клітин/мл) підрахунком у камері Горяєва, рухливість – візуально, під мікроскопом, активність СДГ (мкМ/хв/л; Чухрій Б. М. та ін., 1995), цитохромоксидази (ЦХО; мкМ/хв/л; Чухрій Б. М., Клевець Л.О., 1978); вміст аскорбінової кислоти та продуктів окиснення (дегідроаскорбінову дикетогулонову кислоти; мкг/мл; Климов А. М., 1956), дихальну активність – полярографічно (нг-атом О/0,1мл СС/хв); відновну здатність – потенціометрично (фериціанід калію – 10-4М; мкг перетвореного К3[Fe(СN)6] (мкг К3...)/0,1мл СС/хв; Штольц К.Ф. та ін., 1980). Інтенсивність дихання та відновну здатність сперміїв досліджували при температур +38,5°C у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ; NaCl–0,8г, KCl–0,02г, Na2HPO4–0,11г, KH2PO4–0,02г, MgCl2–0,01г, Н2О до 100 мл). Для вивчення окисно – відновних процесів у статевих клітинах бугаїв та впливу чинників капацитації отриману з придатка сім’яника СС, оцінених за рухливістю, зберігали 6–8 год при температурі 0 – +4°С з наступним інкубуванням 30, 60 і 120 хв (температура +38,5°С) у середовищах капацитації: контрольному – ФСБ та дослідних – ФСБ з додаванням: гомогенату слизової матки корови (СМ; яєчник зі ”свіжою овуляцією” – на місці фолікула утворився згусток крові); фолікулярної рідини (ФР; не інактивована, отримана аспірацією з фолікула діаметром більше 1,5 см, 20% концентрація у пробі); гепарину (ГП, 200 од/мл); 0,1% розчину БСА зі 150 мМ натрію хлориду; амідопірину (АМП, 4Ч10-3М); перекису водню (Н2О2; 1%-ний розчин). Досліджували: стан акросоми сперміїв (Gross N.L., Meizel S., 1989), інтенсивність поглинання кисню та відновну активність без- та за наявності інгібіторів. Використан нгібітори: гліколізу – натрій фторид (NaF; 10–3M); ланцюга дихання мітохондрій: НАД-залежної ланки – амітал (АМ; 5Ч10-3М) термінальної (цитохромоксидази) – натрію азид (NаN3; 5Ч10–2M). Вільнорадикальне окиснення ненасичених жирних кислот, яке супроводжується споживанням кисню, інгібували NаЕДТА (6Ч10-4М; Орехович В.Н., 1977). При цьому, різницю між споживанням кисню чи відновною активністю до- та після додавання інгібітора вважали часткою біохімічного процесу, відповідно, у реалізації кисню та постачанні відновних еквівалентів у позаклітинний простір. Енергетичні потреби сперміїв забезпечували фруктозою (20мМ), піруватом, сукцинатом, глутаматом, a-кетоглутаратом (б–КГ), малатом (по 10-2М). Активність Г-6-ФДГ ( мкМ НАДФН /мл/хв; Farnararo M. et al., 1978, Gruceanu A., Bucsa L., 1979 ) та СДГ визначали за наявності фолікулярної рідини та гепарину, після нкубації 120 хв при +38°С. Спектр білків у процесі виживання сперміїв (при температурі +46,5°С) і після зберігання (при температурі 0 – +4°С) вивчали електрофорезом у поліакриламідному гелі (ПААГ; 7,5% та 12,5% з 0,1%-ним вмістом натрію додецилсульфату) у еякулятах та СС. Ідентифікували окремі білки за допомогою відповідних маркерів з молекулярними масами (ММ): 94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4 кДа (LMW; Pharmacia, Швеція).
