Реферат: Зміни протеїназно-інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину
Реферат: Зміни протеїназно-інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ
І РАДІОБІОЛОГІЇ м. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО
КОВТОНЮК ОКСАНА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 616-006.04:615.477.2:57.042.2:615.277.3
ЗМІНИ ПРОТЕЇНАЗНО-ІНГІБІТОРНОГО БАЛАНСУ ПРИ РОСТІ ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИН З ІНДУКОВАНОЮ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ ДО ЦИСПЛАТИНУ
14.01.07 онкологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертац на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онколог радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Науковий керівник-
академік НАН України, доктор медичних наук, професор Чехун Василь Федорович,
директор, завідувач відділу механізмів протипухлинної терап Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Офіційні опоненти: -
доктор біологічних наук, професор Воронцова Ада Леонідівна,
провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних систем Інститутуекспериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України;
кандидат біологічних наук
Кизим Олександра Йосипівна,
старший науковий співробітник лабораторії біохімії Інституту отоларинголог м. проф. О.С.Коломійченка АМН України
Захист дисертації відбудеться “26” березня 2008 року о 13.30 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментально патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Автореферат розісланий “26” лютого 2008 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук
Л.М. Шлапацька
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Проблема формування лікарської резистентності до цитостатиків , без сумніву, надзвичайно актуальною і навіть ключовою в клінічній практиці, оскільки саме цей феномен у багатьох випадках визначає неефективність хіміотерапії і ставить під загрозу життя онкологічних хворих.
На сьогодні відомо, що резистентність пухлинних клітин до цитостатиків багатофакторним явищем і пов’язана з рядом особливостей клітин на рівні цитоплазматично мембрани, внутрішньоклітинних систем детоксикації, систем репарації (Liang X.J. et al., 2004; Longley D.B. et al., 2005; Чехун В.Ф. и соавт., 2006; Chekhun V.F. et al., 2007). Однією з відомих причин виникнення лікарської резистентності може бути порушення сигнальних шляхів розвитку апоптозу (Biliran H.Jr. et al., 2005; Choi H.K. et al., 2005; Ohmichi M. et al., 2005). Слід зазначити, що серед численних факторів регуляції апоптозу, викликаного дією протипухлинних препаратів, значну роль відіграють серинові протеїнази – представники окремого класу протеолітичних ферментів. Зокрема, на сьогодні встановлена участь серинових протеїназ у регуляц апоптозу, індукованого дією цисплатину – протипухлинного препарату, який широко застосовується в клінічній практиці (Kim R. et al., 2001; Wu C.H. et al., 2002; Downing S. et al., 2003; Chien J. et al., 2006; Alfano D. et al., 2006). За цих обставин логічно припустити участь серинових протеїназ та їх інгібіторів і в формуванн резистентності до цисплатину, тим більше, що дані ферменти та їх інгібітори відіграють суттєву роль у механізмах, які асоціюються зі зниженням накопичення цитостатику в пухлинній клітині (Dong Y. et al., 1997).
Слід зазначити, що в літературі вже є інформація про зв’язок між зміною рівня експресії серинових протеїназ та розвитком резистентності пухлинних клітин до цисплатину (Dong Y. et al., 1997; Osmak M. et al., 1999; Alfano D. et al., 2006), хоча цей зв’язок виявлений лише в системах іn vitro. Що стосується ситуац in vivo, то тут проблема залишається відкритою, і її висвітлення є, безумовно, актуальним; не менш важливим за цих умов є вивчення рівня інгібіторів протеолітичних ферментів, оскільки нормальне функціонування системи протеолізу знаходиться під контролем ендогенних нгібіторів протеолітичних ферментів.
Серед основних природних інгібіторів серинових протеїназ особливий нтерес викликають б1-інгібітор протеїназ (б1-ІП) і б2-макроглобулін (б2М), які є важливою складовою частиною антипротеолітичного потенціалу плазми крові (Hibbets К. et al., 1999; Нероев В.В. и соавт., 2007). Інтегральним показником, який дозволя визначати ендогенну активність серинових протеїназ плазми крові/пухлинної тканини дає уявлення про протеолітичний потенціал біологічного об’єкту, є рівень сумарно протеолітичної активності – ПРА (Веремеенко К.Н. и соавт., 2000). Враховуючи те, що співвідношення рівнів ПРА з рівнями б1-ІП і б2М свідчить про стан динамічної рівноваги між протеїназами та їх інгібіторами в плазмі кров чи пухлинній тканині, не виключено, що співставлення рівнів ПРА/б1-ІП ПРА/б2М в динаміці росту пухлин з різним ступенем чутливості до цитостатику може бути важливим критерієм розвитку лікарської резистентності в умовах іn vivo. Саме цій проблемі – дослідженню змін протеїназно-інгібіторного балансу при рост пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину, присвячена дана робота.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відповідності з планом науково-дослідної роботи інституту за темами: “Вивчення біологічних особливостей пухлинного процесу при формуванні фенотипу лікарської резистентності” (2000–2004 рр., державний реєстраційний № 0101U000670), “Роль гомоцистеїну в процесах формування лікарської резистентності пухлин до дії цитотоксичних препаратів” (2004–2007 рр., державний реєстраційний № 0104U006131).
Мета дослідження. Дослідити зміни протеолітичної активності та вмісту основних нгібіторів протеїназ (плазма крові та пухлинна тканина) при рості експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.
Задачі дослідження.
1. Вивчити кінетику росту резистентної до цисплатину карциноми Герена.
2. Дослідити динаміку змін ПРА, вмісту б1-ІП та б2М в плазмі крові щурів при рості резистентної до цисплатину карциноми Герена.
3. Вивчити кінетику росту та інтенсивність метастазування карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
4. Дослідити динаміку змін ПРА, вмісту б1-ІП та б2М в плазмі крові мишей при рості карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
5. Дослідити динаміку змін ПРА та вмісту б1-ІП у тканин карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
6. Вивчити зміни протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині при рості карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
7. Проаналізувати кореляційні залежності між зміною рівнів ПРА, вмісту б1-ІП і б2М та кінетикою росту експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.
Об’єкт дослідження – миші лінії С57BL/6 з перещепленою карциномою легені Льюїс (вихідного та резистентних до цисплатину підштамів); щури лінії Вістар з перещепленою карциномою Герена (вихідного та резистентного до цисплатину штамів).
Предмет дослідження – індукована резистентність до цисплатину, протеолітична активність та вміст основних інгібіторів протеїназ (б1-ІП та б2М), кінетика росту пухлин, метастазування.
Методи дослідження – використання експериментальних модельних систем пухлинного росту, біохімічні, статистичні.
Наукова новизна. Вперше експериментально доведено, що формування резистентності карциноми Герена та карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики пухлинного росту: пролонгацією латентного періоду росту пухлини та підвищенням швидкості її росту в експоненційній фазі. Встановлено, що зміна кінетики росту пухлин асоціюється з підвищенням рівнів ПРА і б1-ІП та зниженням рівня б2М в плазмі крові.
Вперше виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом резистентно карциноми Герена та рівнями ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001) і б1-ІП (rho = 0,67; p = 0,000002) в плазмі крові. Пряма кореляційна залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) і б1-ІП (rho = 0,65; p = 0,001) в плазмі крові виявлена також при рості карциноми легені Льюїс за умов розвитку резистентності до дії цисплатину. Аналогічний кореляційний зв’язок між об’ємом резистентно до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) і б1-ІП (rho = 0,76; p = 0,0001) був виявлений безпосередньо і в пухлинній тканині.
Вперше за співвідношенням рівнів ПРА/б1-ІП та ПРА/б2М в плазмі крові тварин з різними за чутливістю до цисплатину пухлинами виявлено, що розвиток резистентності карциноми Герена та карциноми легені Льюїс до цитостатику супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в напрямку підвищення рівня ПРА. Показано, що при рості резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс (LLC-27) в пухлинній тканині значно підвищується рівень ПРА та знижується рівень б1-ІП у порівнянні з такими у вихідній пухлині. Виявлено асоціативний зв’язок між змінами протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині при розвитку резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину.
Практичне значення результатів дослідження. Особливості протеїназно-інгібіторного балансу, виявлені в динаміці росту пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину в плазмі крові та пухлинній тканині, можуть бути використані для подальшої розробки методів оцінки чутливості злоякісних пухлин до дії даного цитостатику. Одержан дані можуть також бути підґрунтям для пошуку шляхів профілактики метастазування через вплив на систему протеолізу.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто поставлена мета роботи, сформульовані основні завдання і налагоджені методи дослідження. Автором зібрана та проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації, самостійно виконан наукові дослідження, проведено аналіз первинного матеріалу, статистичну обробку отриманих даних. Автором проведено теоретичне узагальнення результатів роботи, сформульован основні положення і висновки дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на: VI конференції молодих онкологів України (Київ, 2003); ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальн проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005); ІІІ з’їзді онкологів та радіологів СНД (Мінськ, Білорусія, 2004); 18 European association for cancer research (Інсбрук, Австрія, 2004); International Student Congress of Medical Sciences (Гронінген, Нідерланди, 2005); всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Молекулярн основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”, (Київ, 2006); International Medical Students’ Congress in Novi Sad (Сербія, 2006); 17 European Student’s Conference (Берлін, Німеччина, 2006); IV з’їзді онкологів та радіологів СНД (Баку, Азербайджанська Республіка, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 3 статті у провідних фахових журналах, рекомендованих ВАК України та 9 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних з’їздів та конференцій. Отримано 1 патент на винахід в Україні.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, 6-ти розділів, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 11 таблицями та 36 рисунками. Список цитованої літератури налічу 215 першоджерел, у тому числі 195 зарубіжних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи дослідження. В дослідженнях використано 478 мишей-самців лінії С57Bl/6 та 140 щурів-самців лінії Вістар, які були отримані з розплідника віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Утримання тварин та робота з ними проводилися у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт з експериментальними тваринами.
Штами карциноми Герена та карциноми легені Льюїс були отриман з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Перещеплення експериментальних пухлин здійснювали загальноприйнятим методом. Вироблення резистентності пухлин до цисплатину досягали шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин, які одержували від тварин, котрим було проведено курс ін’єкцій цитостатику.
Після перещеплення суспензії пухлинних клітин тварини були поділен на дві групи: контрольну і дослідну. Цисплатин (“Ebewe”, Австрія) вводили тваринам дослідної групи на 7 добу після перещеплення пухлини в дозі 1,2 мг/кг внутрішньочеревинно через день – всього п’ять ін’єкцій. Тваринам контрольної групи за аналогічною схемою вводили стерильний фізіологічний розчин. Пухлини дослідної групи використовували для приготування суспензії клітин, які перещеплювали тваринам другого пасажу. В експериментах з карциномою Герена було проведено 12 послідовних перещеплень, в експериментах з карциномою легені Льюїс 27. Вивчення кінетики росту пухлин та визначення показників системи протеолізу проводили у тварин контрольних груп.
Дослідження на щурах з кариномою Герена були проведені на 2 групах тварин: 1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному Герена (Guerin carcinoma, (GC));
2 група – тварини, яким було перещеплено карциному Герена, попередньо проведену через 12 пасажів на щурах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (GC/R).
В серії досліджень на мишах з кариномою легені Льюїс використовували 4 групи тварин:
1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному леген Льюїс (Lewis lung carcinoma, LLC).
2 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 9 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC- 9).
3 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 19 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-19).
4 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 27 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-27).
Таким чином, в експериментах з карциномою легені Льюїс були використан пухлинні підштами, отримані на різних етапах формування резистентності: LLC-9 (початковий етап), LLC-19 (проміжний етап), LLC-27 (кінцевий етап). В експериментах з карциномою Герена був використаний пухлинний підштам, отриманий на кінцевому етапі формування резистентності до цисплатину (GC/R).
Аналіз кінетики пухлинного росту проводили для кожної тварини за допомогою математичної моделі Вейбула росту гетерогенних пухлин (Weibull W, Sweden S., 1951). Кінетичні параметри росту пухлини визначали для кожної тварини контрольно групи за кінетичними кривими росту, які розраховували методом нелінійної регрес з використанням програми “Microcal Origin 7.0”.
Параметр “а” відображає швидкість росту цілісної пухлини в експоненційній фазі росту. Параметр “tlag” – латентний період росту первинної пухлини. Для аналізу динаміки змін кількості метастазів карциноми легені Льюїс використовували параметр “в” – швидкість метастазування, який характеризує темпи утворення метастатичних вузлів.
Визначення показників системи протеолізу проводили в плазмі кров тварин та пухлинній тканині. Для отримання плазми крові в якост антикоагулянта був використаний 3,8% розчин цитрату натрію в пропорції 9:1. Гомогенат пухлини готували на 0,05М трис-НСl буфері (рН 7,4).
ПРА плазми крові (мкмоль арг/хв на л плазми) чи тканини пухлини (мкмоль арг/хв на г білка) визначали за розщепленням аргінінвмісного лужного білка протамінсульфату спектрофотометричним методом К.М. Веремеєнка (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Принцип методу ґрунтується на визначенні пептидів, що містять аргінін, які відщеплюються від протамінсульфату протеолітичними ферментами пухлинної тканини чи плазми крові, що дозволяє визначати сумарну активність нейтральних серинових протеїназ. Вміст б1-ІП у плазмі крові (г/л) та тканині пухлини (мкг/мг тканини) визначали за здатністю останнього пригнічувати гідроліз трипсином синтетичного субстрата N- бензоїл -DL-аргінін-p-нітроаніліда (БАПНА).
Вміст б2М в плазмі крові (г/л) визначали за здатністю нгібітора утворювати з трипсином активний комплекс, який розщеплює синтетичний субстрат БАПНА, але є нечутливим до інгібітора з бобів сої (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Вміст білка в досліджуваних зразках визначали за методом Lowry O.H. та співавт. (1951).
