Курсовая работа: Источники и пути образования оксида азота в организме
Рис.4. Стимуляция и ингибиция индуцибельной NO-синтазы [8].
Активация рецепторов гепатоцитов, клеток моноцитарно-макрофагальной системы и некоторых клеток крови цитокинами (Cyt) и липосахаридами (LPS), под влиянием которых происходит индукция индуцибельной синтазы окиси азота, синтезирующей NO из L-аргинина. Блокада (ХХ) i-NOS глюкокортикоидами или другими блокаторами ее активности. Образовавшийся NO диффундирует в межклеточное пространство [8],[9].
Таблица 2. Синтетические и природные агенты, модулирующие активность NO-синтаз [1].
| Типы модулятора | Изоформа фермента | ||
| Noc-I | Noc-II | Noc-III | |
|
Активаторы/индукторы Ингибиторы |
Глутамат, N-метил-D-аспартат L-тиоцитруллин, 7-нитроиндазол, нитроаргинин |
Цис-платина, интерлейкин 1-β, интерферон-γ, липополисахарид, фактор некроза опухоли -α и –β, γ-излучение N-(3-(аминометил)-бензил)-ацетамидин, N6-(1-иминоэтил)-бензил)-ацетамидин; аминогуанидин, дексаметазон, ингибиторы сериновых протеаз, интерлейкин-4 и -10; L-NMMA; простагландин Е2, простациклин; N6-(1-иминоэтил)-L-лизин; 3-гидроксиантраниловая кислота; метотрексат |
Субстанция Р, АДФ, сдвиговое напряжение и пульсации давления крови, тромбин, гипомагнеземия, гистамин, Са2+-ионофоры, лейкотриены, олеиновая кислота, фактор активации тромбоцитов, аденозин, АТФ, ацетилхлин, брадикинин, серотонин; хлористый калий, эндотелин. Нитроимидоорнитин; иминоэтилорнитин, L-НАМЭ; АДМА |
Неферментативное образование оксида азота
Для биологических тканей помимо генерации оксида азота в ходе ферментативных реакций с участием NOS обнаружена возможность превращения нитрит-аниона в NO [7]. Этот процесс происходит в условиях ацидоза и при наличии восстановленных форм гемсодеращих белков, что характерно для такого патологического состояния как ишемия [3].
Так, образование оксида азота из нитрита может происходить в соответствии со следующей последовательностью реакций:
NO-2 + H +
HNO2
HNO2 {NOOH}
{NOOH} + NO-2
N2O3 + OH-
N2O3 NO
+ NO2
Кроме того, ионы NO-2 способны восстанавливаться до оксида азота в ходе окислительно-восстановительных реакций, акцептируя электроны с дезокси-форм гемсодержащих белков. Так, при взаимодействии NO с восстановленным гемоглобином происходит окисление Hb2+ до metHb и восстановление ионов NO-2 до NO:
Hb2+ + NO-2
+ 2H + metHb + NO + H2O
Нитритредуктазная активность также показана для миоглобина, цитохром-с-оксидазы и цитохрома Р-450.
Факт образования NO в биологических тканях из нитрит-аниона позволил предположить возможность существования механизма циклического превращения оксида азота в организме:
L-Arg NO NO-2/NO-3
NO
Данное положение нашло отражение в концепции цикла оксида азота в организме млекопитающих. При этом NO-синтазная компонента обеспечивает эндогенный синтез NO, NO-2, NO-3 в присутствии кислорода. В условиях гипоксии или функциональной нагрузки, при которой осуществляется активное потребление кислорода, NO-синтазный механизм ингибируется [10].
В то же время дефицит кислорода приводит к активации нитритредуктазной компоненты цикла. Считается, что циклизация метаболических путей обеспечивает высокую степень упорядоченности и связанности систем биохимических реакций. Таким образом, механизм циклических превращений для NO и других высокореакционных азотсодержащих соединений гарантирует не только их эффективную переработку, но и достаточно быстрое выведение путем превращения в менее активные вещества, например ионы NO-2 и NO-3[3].
Методы определения оксида азота
Описанные в литературе методы определения NO можно условно разделить на прямые (таблица 2) и косвенные (таблица 3). В число первых входят те, с помощью которых осуществляется непосредственная регистрация NO, либо его комплексов. Прежде всего, это метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) как средство изучения молекул с неспаренным электроном. Предложено использовать в качестве индикаторов NO регистрируемые методом ЭПР нитрозильные железосодержащие комплексы, устойчивые в биологически активных средах [1].
В живой ткани SH-содержащие белки, пептиды и аминокислоты образуют такие парамагнитные аддукты общего состава Fe(NO)2(SR)2, спектры ЭПР которых являются ассиметричными вариацией g-фактора от 2.01 до 2.05. однако из-за большого разнообразия естественных акцепторов NO и вариабельности их содержания, количественное определение этого радикала таким образом вряд ли возможно. В то же время гемопротеиды (гемоглобин, миоглобин, цитохром а3 и др.) образуют нитрозильные парамагнитные комплексы, имеющие широкий спектр ЭПР [1].
С разрешенной сверхтонкой структурой (СТС) в области значений g-фактора меньше 2. Анализ полученных спектров ЭПР свидетельствует о том, что структура указанных комплексов имеет ромбическую симметрию [13].
Таблица 3. прямые методы регистрации оксида азота[1].
| Инструментальный метод | Соединение-индикатор/реакция-индикатор | Чувствительность |
| ЭПР | Fe-(NO)2-(SR)2 | |
| ЭПР | Hb-Fe(II)-NO | 5 мкМ |
| ЭПР | (ДТК)2-Fe(II)-NO | 1 мкМ |
| ЭПР, L-линия | Фьюзинит-NO | 1 мкМ |
| Хемилюминесценция | NO + O3 = hν + NOx | 20 нМ |
| Амперовольтметрия | NO + e = NOx | 10 нМ |
Более перспективным представляется метод с использованием карбоксигемоглобина в качестве экзогенной спиновой ловушки оксида азота. На состояние Hb-Fe(II)-CO не оказывает влияния степень оксигенации среды, а поскольку прочность связывания NO с гемоглобином на три порядка больше, чем прочность связывания СО, то можно ожидать практически количественного образования нитрозил-гемоглобина. Следует, однако, отметить, что гемоглобин или его производные имеют ряд особенностей, ограничивающих применение их в качестве естественной или экзогенной спиновой ловушки. Проникновение крупных молекул в клетки к месту синтеза оксида азота крайне затруднено, поэтому включаться в комплекс и становиться ЭПР-видимой будет лишь часть оксида азота, не метаболизированная в период диффузии. Кроме того, недостаточно определены пути и скорости дальнейших превращений Hb-Fe(II)-NO в живой клетке [1].
При прямом определении NO методом ЭПР-спектрометрии перспективным представляется использование в качестве спиновой ловушки производных дитиокарбаминовой кислоты (ДТК). В организме они образуют ЭПР-видимые комплексы состава (ДТК)2-Fe-NO, включающие в себя «свободное» железо [14]. Эти комплексообразователи позволяют изучать образование оксида азота в тканях животных, в гомогенах, в культуре клеток и биологических жидкостях. Важно, что при оптимальных нетоксичных концентрациях ДТК их высокая скорость взаимодействия с NO существенно снижает вероятность реакции оксида азота с другими биомолекулами, в том числе с радикалами, и тем самым ограничивает влияние этих реакций на результаты ЭПР-спектрометрии [1].
Предложен оригинальный метод ЭПР-дозиметрии NO, в котором применена спиновая макроловушка – фьюзиниты. Это частицы размером 10 мкм, выделяемые из угля. Они обладают способность поглощать оксид азота с изменением характеристик собственного ЭПР-спектра. Не подвергаясь метаболизму, они не оказывают токсического действия на клетки, и после поглощения путем фагоцитоза могут быть использованы в качестве аналитического средства, специфического к оксиду азота [1].
Наиболее чувствительным среди методов определения NO в организме или в клеточных системах является электрохимический метод. Он основан на каталитическом окислении оксида азота полимерным металлопорфирином (полупроводником n-типа), которое протекает при 630 мВ. Диаметр электрода может достигать 0,2 мкм, что позволяет измерять внутриклеточное производство оксида азота. Поскольку время ответа электрода составляет около 10 мс, часть радикалов, вступающая в очень быстрые реакции (например, с супероксид-радикалом), не может быть зарегистрирована [15]. С помощью этого методы были проведены измерения содержания оксида азота в крови человека [1].
Хемилюминесцентный метод основан на регистрации фотонов, излучаемых в реакции NO с озоном. Несмотря на высокую чувствительность, применение его к биологическим объектам затрудняется сложным этапом доставки радикала в анаэробную газовую фазу. Кроме того, на выход люминесценции оказывают влияние аммиак, олефины, окислы серы и другие продукты, выделяющиеся в результате биологической активности организма и часто содержащиеся в стенках аппаратуры [1].
Среди непрямых методов определения NO (таблица 3) наиболее распространенным методом оценки его синтеза является реакция на нитрит-анион с использованием реагента Грисса (раствор сульфаниламида и N-(1-нафтил) -этилендиамида в 2,5%-ной ортофосфорной кислоте), которая дает окрашенный дазопродукт с максимумом поглощения при 548 нм. Обычно отношение содержания NO-2/NO-3 у млекопитающих составляет 1 : 10. и хотя содержание нитрит-аниона менее подвержено влиянию состава питания, при необходимости более полного определения продукции оксида азота измеряют и содержание нитрат-аниона. Для этого NO-3, выделяющийся в культурную среду или биологические жидкости, восстанавливают металлическим кадмием, импрегнированным медью, или ферментативно, нитратредуктазой [1].
Таблица 4. косвенные методы определения оксида азота [1].
| Соединение-индикатор | Принцип определения | Метод регистрации, чувствительность |
| Метгемоглобин | Hb-Fe(II)-O2 + NO = =Hb-Fe(III) + NO-2 | Фотометрия, 2 нм |
| Иминонитроксид (ИН) | Нитронил нитроксид+NO = =ИН | ЭПР |
| Нитрит-анион | NO-2 + реагент Грисса = диазопродукт | Фотометрия, 1 мкм |
| Нитрит-анион | ФТИО* + NO = NO-2 | То же |
| Нитрат-анион |
NO-3 + Cd = NO-2 NO-3 + нитратредуктаза = =NO-2 |
То же |
| Нитрит-анион | NO-2 + S2O-4 = NO+Hb-Fe(II) = Hb-Fe(II)-NO | ЭПР, 1 мкм |
| Цитруллин | 3H-L-аргинин + NOc = 3H-L-цитруллин | ВРЖХ, радиометрия; 0,1 мкм |
| цГМФ | NO + 3Н-ГМФ + ГЦ = =3Н-цГМФ | Хроматграфия, радиометрия |
| бис-Формазан (БФ) | ТНС* + NOc + НАДФ.Н = =БФ | Гистохимия |
| НАДФ.Н | НАДФ.Н + L-аргинин + NOc = НАДФ.Н | Флуорометрия |
