Быстрый поиск

Дипломная работа: Микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров

А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t – время протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1г препарата или 1см3 жидкого ферментного раствора.

Величина А рассчитывается по формуле (3):

А=(а-ак)×1,4×К, (3)

где A – количество аминного азота, мг;

а – количество 0,1н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1см3 опытной пробы, см3;

ак – то же, для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.

2.2.15 Определение активности липазы (ЛС) (модифицированный метод Ота, Ямада)

За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 21мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и температуре 37оС в течении 1часа.

Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливкового масла.

Необходимые реактивы. Раствор оливкового масла (субстрат); 2%-ный раствор поливинилового спирта; 1н раствор соляной кислоты (HCl); 0,05н раствор гидроксида натрия (NaOH); фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0; 1%-ный раствор фенолфталеина; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фермента.

Техника определения. 5см3 эмульсии субстрата и 4см3 буфера с рН 7,0 помещают в колбу Эрленмейера на 100см3, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37оС в течении 10 минут. Затем к смеси добавляют 1см3 раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37оС в течении 1 часа, после чего немедленно добавляют 30см3 этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором NaOH в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до исчезновения окраски.

Контрольную пробу готовя следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37оС, добавляют 30см3 этанола, затем 1см3 ферментного раствора и смесь немедленно титруют.

Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (4):

ЛС=, (4)

где ЛС – липолитическая активность, ед/г;

А – разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см3;

Т – титр щелочи;

В – концентрация образца ферментного раствора, г/см3.

2.2.16 Определение концентрации взвешенных веществ

Предварительно готовят фильтры следующим образом: промывают горячей водой (дистиллированной), затем высушивают до постоянного веса в сушильном шкафу при температуре 105оС.

Для определения содержания взвешенных веществ их отделяют, фильтруя сточную воду, объемом 50-100 см3 через бумажный фильтр средней плотности, доведенный до постоянного веса. Оставшийся на стенках стакана осадок смывают небольшой порцией фильтрата и переносят на фильтр. Осадок смывают небольшим количеством (10-15 см3) спиртоэфирной смеси для удаления веществ, сорбированных на поверхности взвешенных веществ. Фильтр с осадком помещают в тот же бюкс, в котором его взвешивали до фильтрования, и высушивают в сушильном шарфу при температуре 105оС в течение 2 часов. Бюкс закрывают крышкой и охлаждают в эксикаторе над прокаленным хлоридом кальция. Затем взвешивают с абсолютной погрешностью не более 0,0002 г.

Высушивание, охлаждение, взвешивание повторяют до достижения постоянной массы.

Содержание взвешенных веществ определяют по формуле (5):

Х = , (5)

где Х – содержание взвешенных веществ;

m1 – масса бюкса с высушенным фильтром и осадком, г;

m2 – масса бюкса с высушенным фильтром, г;

V – объем воды, взятой для фильтрования, см3.

2.2.17 Определение содержания органических веществ

Для определения химического потребления кислорода (ХПК) берут 1-5 см3 профильтрованной воды, прибавляют 2,5 см3 0,25н раствора дихромата калия, 0,4 г сульфата ртути (II), 0,2-0,4 см3 сульфата серебра и при перемешивании приливают концентрированную серную кислоту (7,5 см3 на 1 см3 пробы, 15 см3 на 5 см3 пробы). При этом температура раствора поднимается до 100оС. Через 2 минуты раствор охлаждают до комнатной температуры, приливают 100 см3 дистиллированной воды и титруют избыток дихромата калия 0,25н раствором соли Мора в присутствии 10-15 капель N-фенилантраниновой кислоты или 3-4 капель ферроина. Изменение окраски в первом случае от красной до изумрудно-зеленой, во втором – от голубовато-зеленой до красно-голубой.

Параллельно проводят контрольный опыт без сточной воды.

ХПК выражают в миллиграммах кислорода на 1 дм3 воды (мгО/дм3).

Расчет производят по формуле (6):

(V1-V2)×k×0.25×8×1000

ХПК = , (6)

где ХПК – химическое потребление кислорода, мг О2/дм3;

V1,V2 – объемы 0,25н раствора соли Мора, израсходованные на титрование в контрольном опыте и пробы сточной воды, см3;

k – поправочный коэффициент для приведения концентрации раствора соли Мора к точно 0,25н;

0,25 – концентрация раствора соли Мора;

8 – эквивалент кислорода;

V – объем сточной воды, взятой на определение, см3.

2.2.18 Отбор проб методом асимметрической бахромы

Для сопоставимости результатов исследований различных факторов или технологических параметров необходимо исключить влияние топографии шкуры, полуфабриката или кожи. В этом случае для отбора средней пробы пользуются методом асимметрической бахромы (МАБ), который заключается в следующем. Намечают необходимое число вариантов исследования и задаются числом образцов (полосок), входящих в группу, предназначаемую для каждого варианта (обычно не менее 4). Чем больше число образцов, тем более достоверным будет среднее значение, характеризующее вариант. Размер образца предопределяется набором физико-механических или физических испытаний, которые предполагается провести, а все образцы должны уложиться в прямоугольник, вписанный в чепрачную часть, показанный на рисунке 3

5	1
4	2
3	3
2	4
1	5
5	1
4	2
3	3
2	4
1	5

Рисунок 3 - Схема отбора проб методом асимметрической бахромы

2.2.19 Определение колористических показателей волосяного покрова

Колористические показатели волосяного покрова определяются на приборе «Пульсар». Образцы тщательно расчесываются, накрывают стеклом и фотографируют. Далее работают при установлении кнопки «режим» - 3.

Предварительно прибор прогревают в течение 30 минут, затем нажатием кнопки «сброс» очищают панели вывода.

Первоначально производят калибровку прибора, для этого устанавливают «режим» - 0 (калибровка прибора); «вывод» - 0. Белую пластину помещают на место отражающего образца; черную – на место измеряемого образца, нажимают «пуск », после загорания «Б» извлекают черную пластину. Снова нажимают «пуск», загорается «I» извлекают белую пластину. Устанавливают на индикаторе «режим» - 1; «вывод» - 0 (измерение прозрачных проб) на место прозрачного образца – дистиллированную воду, нажимают пуск.

Для измерения рабочего образца устанавливают пробу. Нажимают «пуск», снимают показания индикатора в соответствии литературными данными.

2.2.20 Определение содержания несвязанных жировых веществ (ГОСТ 26129-84 Шкурки меховые и овчина шубная выделанные. Методы определения несвязанных жировых веществ)

Навеску измельченной кожевой ткани или волоса массой 0,5-0,6 г взвешенною с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в бумажную гильзу и закрывают тампоном. Гильзу закрепляют в предварительно доведенной до постоянной массы колбе и соединяют колбу с обратным холодильником. В колбу заливают 50 см3 хлороформа или дихлорэтана. Колбу с растворителем нагревают на электрической плитке с асбестовым покрытием. Продолжительность экстрагирования при анализе кожевой ткани - 45 минут, при анализе волоса – 15-20 минут. Растворитель должен постоянно кипеть и, охлаждаясь и стекая с холодильника, попадать в центр гильзы. В дальнейшем растворитель отгоняют и колбу с жировыми веществами доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 128-130˚С. Продолжительность первой сушки 30 минут, последующих – по 15 минут.

Массовую долю жировых веществ вычисляют по формуле (8):

Х1 = ×100, (8)

где Х1 массовая доля жировых веществ;

m – масса колбы с экстрагированными веществами, г;

m1 – масса пустой колбы, г;

m2 – масса навески кожевой ткани или волоса, г.

3 Экспериментальная часть

В настоящее время проблема загрязнения водного бассейна антропогенными сбросами во всем мире стоит на первом месте. Для региона республики Бурятия эта проблема является наиболее важной, так как на нашей территории находится мировое наследие – озеро Байкал. Характер стоков, поступающих в водный бассейн достаточно разнообразен, так как на территории республики находится довольно много средних и мелких предприятий по переработке пушно-мехового сырья, по производству мясной и молочной продукции, немаловажное значение имеет загрязнение бытовыми стоками. К основным загрязнителям стоков пушно-меховых предприятий относятся соли хрома (III) и (VI), красители, ПАВ, а также жировые вещества, которые образуются при проведении процессов отмоки и обезжиривания. При очистке сточных вод, содержащих жировые вещества, на первом этапе применяют физические и физико-химические методы очистки, наиболее распространенным из которых является метод флотации, на последующих этапах очистки большое распространение получили биологические методы, основанные на применении микроорганизмов-деструкторов жировых веществ. Известно, что деструкция жира на первом этапе происходит до глицерина и карбоновых кислот (основных составляющих в структуре жиров), интерес представляют последующие продукты деструкции. В связи с этим, целью дипломной работы являлось изучение морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, выделенных из жировых материалов и из сточных вод после процесса обезжиривания, и исследование деструкции жировых веществ прокариотическими микроорганизмами.

3.1 Восстановление и исследование морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, деструктирующих жировые вещества

С целью восстановления свойств микроорганизмов в жидкие питательные среды объемом 150 см3 на основе мясопептонного бульона (МПБ) и синтетической среды Рана, в которой в качестве источника углерода служил нерпичий жир (п.2.2.1), внесли исследуемые культуры в количестве 105 кл/ см3 (петлей). Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см3 в термостате марки «ТС-80М-2» при температуре (37±0,5)˚С в течение 24 часов в состоянии покоя. После истечения заданного времени культивирования перенесли 0,1 мл. бактериальной суспензии и произвели посев на соответствующие плотные среды в чашки Петри.

Для исследования морфолого-культуральных свойств прокариотических организмов была восстановлена культура микроорганизмов методом штриха и разведений (п.п.2.2.2-2.2.3) на мясопептонном агаре (МПА) и на синтетической среде Рана. Культивирование проводили в перевернутых чашках Петри в термостате при температуре (37±0,5)˚С в течение 24 часов для МПА и 48 часов для среды Рана.

Выделенные культуры были обозначены следующим образом: Нв – микроорганизмы, выделенные из жира нерпы, но адаптированные к росту на шерстном жире; Н – микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; В – выделенные из шерстного жира; 3, 8 – культуры микроорганизмов, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания меховой овчины.

При рассмотрении характера роста культур на разных средах можно отметить, что колонии микроорганизмов, выращенных на мясопептонном агаре, характеризуются более значительными размерами, по сравнению с культурами, выращенными на синтетической среде Рана, что обусловлено повышенной чувствительностью культур к агрессивной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода нерпичий жир, в количестве 1 г/дм3.

Исследование морфолого-культуральных свойств, выделенных колоний микроорганизмов проводили по следующим параметрам: окрашиванию по методам Грама, Трухильо и Леффлеру (п.2.2.4), определение подвижности методом раздавленной капли (п.2.2.6) и определение культуральных свойств (п. 2.2.5).

Результаты исследования морфолого-культуральных свойств бактерий представлены в таблице 3 и на рисунках А1-А5.

Таблица 3 – Сравнительная таблица морфолого-культуральных признаков исследуемых культур

Признак	Тип культуры
	Н		Нв		В	3	8
Место выделения	Природные жиры: шерстный, нерпичий.					Сточные воды после проведения процесса обезжиривания
Морфология	Коккобактерии					Палочки, сцепленные попарно и более
Рельеф колоний	Плоские
Прозрачность	Непрозрачная
Края колонии	Ровные
Структура колонии	Гомогенная
Консистенция	Мазеобразная
Окраска по Граму	+	+		+		+	+
Окраска по Трухильо	-	-		-		-
Окраска по Леффлеру	+	+		+		+	+
Подвижность	+	+		+		+	+
Расположение жгутиков	Перетрихи
рН (опт)	5,6-7,5
Температура (опт), оС	25-40
Форма колоний	Точечная