Быстрый поиск

Дипломная работа: Микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров

Окрашивание мазков показало, что все культуры являются грамположительными мелкими палочками, аспорогенными с перетрихиальным расположением жгутиков. Более подробно форму бактерий можно рассмотреть на рисунках 2-6, полученных в результате фотографирования окрашенных мазков на микроскопе Ломо Микмед–1 с помощью цифрового фотоаппарата «Samsung». По форме бактерий культуры типа Н, Нв и В следует отнести к коккобактериям мелким палочкам, близким к овальной форме, в то время как культуры типа 8, 3 представляют собой бактерии, диплобактерии и стрептобактерии. Размер исследуемых микроорганизмов варьируется в пределах 0,1-0,5 нм.

При рассмотрении раздавленной капли бактериальной суспензии было отмечено броуновское движение бактерий, сопровождающееся вращательным движением, обусловленным перетрихиальным расположением жгутиков.

Результаты изучения культуральных свойств представлены на рисунках А6-А10. При изучении культуральных свойств установлено, что все культуры имеют точечные колонии матового цвета, непрозрачные, с ровными краями.

Для определения липолитической активности был произведен посев в бульон Штерна, содержащего в качестве субстрата глицерин. Посев производили следующим образом: для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов производили посев на скошенную синтетическую среду и культивировали в течение 24 часов при температуре (37±0,5)˚С, затем произвели смыв полученной биомассы 10 см3 бульона Штерна в пробирки, и термостатировали при температуре (37±0,5)˚С в течение 120 часов в термостате марки «ТС-80М-2».

При рассмотрении поведения культур в данной среде выявлено, что уже к 24-48 часам культивирования имело место переход окраски бульона из розового в ярко – красный (рисунок А11), образование хлопьевидного осадка и газообразование. К 72 часам культивирования наблюдалось появление биопленки и пристеночного кольца, а к 96 часам посветление сред до светло-розового цвета. При рассмотрении окраски по столбу жидкости была отмечена ее дифференсация: окраска была более интенсивной в верхней части жидкости, что возможно обусловлено более высоким содержанием кислорода в этом слое. Следовательно, для роста данных микроорганизмов необходим кислород.

Также было отмечено изменение активной реакции среды (рН=7 контрольной пробы). Через 24 часа культивирования после заражения бульона Штерна при температуре (37±0,5)˚С произошло понижение рН с 5 до 3 для всех исследуемых сред за исключением сред, содержащих культуру 8, активная реакция которой сохранялась в течение 72 часов и составляла рН=4, а к 120 часам культивирования повысилась до рН=5. Для остальных культур было характерно плавное повышение активной реакции среды до рН=5 к окончанию культивирования (120 часов).

На основе проведенных исследований следует отметить, что исследуемые культуры микроорганизмов обладают липолитической активностью, т.е. вовлекают вещества жировой природы (в качестве источника углерода) в конструктивный и энергетический обмен, что заметно по таким показателям среды как: появление хлопьевидного осадка, изменение цвета от восстановления индикатора при изменении рН. Однако выявления культуры с чётко выраженной максимальной величиной активности по липазе не было наблюдается одинаково равнозначные характеристики роста на специализированной среде в течение всего периода культивирования.

3.2 Изучение толерантности исследуемых культур к факторам внешней среды

Для исследования влияния внешних факторов на динамику роста и развития микроорганизмов, а также для культур, продуцирующих суммарный продукт жизнедеятельности микроорганизмов с максимальной липолитической и минимальной протеолитической активностью провели скриннинговое исследование.

Для этого культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см3, содержащей 200 мл бактериальной суспензии на основе жидкой синтетической среды Рана (п.2.2.8). Количество вводимой биомассы 105 кл/см3 на 200 см3 рабочей жидкости. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температуре (37±5)°С, осуществляя переменное механическое воздействие на встряхивателе «Shaker Type-357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки в течение 48 часов. Для изучения динамики активности микроорганизмов через каждые 24 часа снимали такие показания, как подсчет величины КОЕ (п.2.2.9), мутность (п.2.2.10), кислотность (п.2.2.11), активная реакция среды (п.2.2.16) после 48 часов культивирования был определен суммарный продукт жизнедеятельности микроорганизмов (п.2.2.12). Кроме того, определяли показатели для контрольной среды – не зараженной культурами микроорганизмов.

Для определения липолитической и протеолитической активностей эндофермента бактериальную суспензию после 48 часов культивирования подвергали центрифугированию при 5000 об./мин. в течение 15 минут. Осадок, образующийся в результате центрифугирования замораживали, после чего растирали в фарфоровой ступке со стеклом, добавив 100 см3 дистиллированной воды. Полученную суспензию центрифугировали при 5000 об./мин. 10 минут для удаления стекла. После того как, стекло удалили в полученную жидкость вводили 30% от объема (NH4)2SO4 для высаливания белка и центрифугировали при 5000 об./мин. в течение 15 минут, после чего на стенках центрифужной пробирки образовывался желтый налет, который собирали в колбу Эрленмейера объемом 100 см3 и приливали 30 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивали и и отбирали пробы для определения липолитических, протеолитических свойств (п.2.2.13, 2.2.14) и суммарного продукта жизнедеятельности микроорганизмов.

Для определения липолитических и протеолитических свойств экзофермента в над осадочную жидкость полученную после первого центрифугирования при определении свойств эндофермента вводили 30% от объема (NH4)2SO4 для высаливания белка, и проводили все операции аналогично как при определении активностей эндофермента.

Протеолитическую активность определяли по методу Вильштеттера и Вальдшмидта-Лейтца (п.2.2.13) и рассчитывали по формулам (2) и (3).

Пример расчета протеолитической активности для культуры Н:

а = 1,4 мл.; ак = 1,29 мл.

А = (1,4-1,29) × 1,4 × 1 = 0,154 мг.

0,154 × 12 × 100

ПС = = 3,08 ед. на 1 г. культуры.

3 × 1 × 2 × 10

Липолитическую активность определяли по модифицированному методу Ота, Ямада (п.2.2.14) и рассчитывали по формуле (4).

Пример расчета липолитической активности для культуры Н:

В = 46,3 г/см3; А = 0,25 см3.

0,25 × 2 × 50

ЛС = = 0,54 ед./г.

46,3

Дальнейшие расчеты проводили аналогичным образом. Результаты, полученные после проведения скриннинговых исследований, представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты проведения скриннинговых исследований

Показания	Тип культуры
	Н		Нв		В		3		8		Контр
	0ч	48ч	0ч	48ч	0ч	48ч	0ч	48ч	0ч	48ч
рН	7,25	7,40	7,28	7,44	7,30	7,40	7,33	7,40	7,37	7,10	7,31
Кислотность, г/дм3	1,26	1,56	1,20	1,26	1,20	1,38	1,50	1,20	1,50	1,44	1,20
Оптическая плотность D5402	7,00	8,10	6,20	5,60	5,80	5,60	6,60	4,60	4,00	5,80	5,60
КОЕ, кл/см3	3,3×105	5,1×105	1,2×106	6,1×106	5,8×105	4,1×106	7,3×105	5,3×106	2,4×106	6,8×106	-
Сум-ый продукт жизн-ти, гр./дм3	0,08		0,05		0,17		0,04		0,03		-
Протеолитическая активность экзофермента, ед./гр.	3,08±0,12		5,32±0,25		8,26±0,23		3,36±0,27		5,60±0,32		-
Протеолитическая активность эндофермента, ед./гр.	1,82±0,23		3,64±0,19		2,66±0,31		5,60±0,24		11,2±0,30		-
Липолитическая активность экзофермента, ед./гр.	0,54±0,26		1,16±0,23		0,26±0,14		1,79±0,12		1,79±0,23		-
Липолитическая активность эндофермента, ед./гр.	0,83±0,21		2,15±0,17		0,76±0,28		2,87±0,26		3,59±0,11		-

Полученные результаты показывают, что для всех культур, за исключением культур 3 и 8, характерен рост кислотности к 48 часам культивирования, что связано с вовлечением жирового материала в конструктивный и энергетический обмен микроорганизмами. В результате метаболических процессов наблюдается деструкция жирового материала до глицерина и карбоновых кислот, в результате образования которых повышается кислотность среды. К примеру, кислотность среды, содержащей культуру Н возрастает с 1,26 г/дм3 до 1,56 г/дм3, что соответствует наиболее максимальному возрастанию кислотности по сравнению с остальными средами. Наименьшая интенсивность возрастания данного показателя отмечена для сред, содержащих культуру Нв - увеличение с 1,2 г/дм3 до 1,26 г/дм3.

Оптическая плотность определяли на фотоколориметре ФЭК-4 при длине волны 540 нм, чувствительности 2 и толщине поглощающего слоя 3,025 мм. При изучении динамики изменения значений мутности можно отметить, что для бактериальных суспензий культур Н и 8 характерен рост данного показателя в течение 48 часов культивирования, связанный с наступлением для культур микроорганизмов благоприятной для их бурного развития лог-фазы. Наибольшее увеличение значения мутности характерно для среды, содержащей культуру 8. К 48 часам культивирования наблюдался рост мутности с 4,0 до 5,8, что связано с интенсивным вовлечением природных жировых веществ в клеточный метаболизм. Уменьшение значения мутности наблюдалось у бактериальных суспензий культур Нв, В и 3. Данная динамика может объясняться процессами автолиза, в частности возрастанием лимитирования по субстрату и образованием альдегидов

Изменение рН рабочей жидкости проводили на цифровом иономере Анион 7000. Из данных таблицы видно, что уменьшение рН наблюдалось только для среды, содержащей культуру 8, что вероятно связано с деструкцией жира и образованием глицерина и карбоновых кислот, обуславливающих кислую реакцию среды.

О O

// //

СН2 – О – С R1 – C

\ \

R1 CH2 – OH OH

ê О ç O

// CH – OH + //

СН – О – С ® ç R2 – C

\ CH2 – OH \

R2 OH

ê O O

// //

CH2 – O – C R3 C

\ \

R3 OH

В течение 48 часов вероятно происходит расщепление карбоновых кислот микроорганизмами до соответствующих альдегидов, которые окисляются до кислот или полимеризуются. В результате чего значение рН через 48 часов увеличилось для сред, содержащих культуры Н, Нв, В и 3.

O O

// //

R – C ® R – C

\ \

OH H

Также наблюдался устойчивый рост величины КОЕ в течение всего периода культивирования с 105 по 106 кл/см3, что указывает на достаточное количество субстрата в синтетической среде и его утилизации.

На основании проведения скриннинговых исследований можно отметить, что все исследуемые культуры осуществляют деструкцию жирового материала. Деструкция жирового материала на первом этапе возможно происходит до глицерина и карбоновых кислот, это подтверждается увеличением значений кислотности в первые часы культивирования. В результате проведения предварительного скрининга и изучения морфолого-культуральных признаков исследуемых прокариотических организмов были отобраны наиболее активные культуры для проведения дальнейших исследований. Интерес представляла культура 8, характеризующаяся максимальным ростом оптической плотности среды до 48 часов культивирования и культура Нв с наибольшим значением липолитической активности. Для выбранных культур провели скриннинговое исследование через 24ч и 48часов по которому сделали подбор оптимального времени культивирования. Результаты представлены в таблице 5 и на рисунках 4-6.

Таблица 5 – Подбор оптимального времени культивирования

Показания	Тип культуры
	8			Нв
	0ч	24ч	48ч	0ч	24ч	48ч
рН	7,64	7,61	7,67	7,65	7,63	7,66
Кислотность, г/дм3	1,30	1,40	1,70	1,40	1,60	1,50
Оптическая плотность D5402	4,50	5,20	3,60	4,80	4,90	4,70
КОЕ	2,70×106	5,10×106	8,40×106	9,20×105	2,50×106	4,70×106
Сум-ый продукт жизн-ти, г/дм3	-	0,05	0,03	-	0,03	0,01
Протеолитическая активность, ед./гр.	-	2,80±0,25	2,24±0,16	-	4,48±0,22	1,68±0,15
Липолитическая активность, ед./гр.	-	4, 53±0,21	1, 23±0,24	-	3, 47±0,18	1, 19±0,27